cDNA庫：

• 借助酶逆轉錄酶從信使RNA（mRNA）產生的DNA副本稱為cDNA。
• 一組cDNA片段已將其克隆到一個單獨的矢量分子中，該分子構成了生物體的一部分轉錄組，並將其存儲為庫，稱為cDNA文庫。

cDNA庫的原理：

• 為了構建cDNA文庫，產生了來自生物體mRNA序列的DNA拷貝，然後克隆它們。
• 給出一詞cDNA，因為庫中的所有DNA均與mRNA互補，並且通過mRNA的反轉錄產生。
• 大多數真核DNA由未轉錄到mRNA的重複序列組成，在cDNA庫中，序列未表示。
• 應當記住，原核生物和較低的真核生物不包含內含子，並且通常不需要為這些物種的cDNA製備。
• 因此，cDNA文庫僅由較高的真核生物創建。
• 為了構建cDNA文庫，細菌和噬菌體DNA都可以用作載體。

cDNA庫的建設涉及的過程：

1.從真核細胞中提取mRNA：

• 首先，收集並純化了其餘RNA的mRNA。
• 許多其他方法可用於純化RNA，例如Trizol提取和色譜柱純化。
• 通過使用寡聚DT核苷酸塗層樹脂，僅在隻有具有多A尾的mRNA才能結合的情況下進行柱純化。
• 通過使用寡聚DT核苷酸塗層樹脂，僅在隻有具有多A尾的mRNA才能結合的情況下進行柱純化。
• 其餘的RNA洗脫了。
• 使用洗脫緩衝液洗脫mRNA，並進行一些熱量，以將mRNA鏈與寡-DT分開。

2. cDNA結構：

• 為了構建cDNA，有幾種不同的方法。這些討論如下：

一世）。RNase方法：

• 原則：
  • 通過使用逆轉錄酶，合成互補的DNA形成RNA：DNA雙鏈體。現在，將RNA鏈被切到，然後被DNA取代。
• 腳步：
• 第一步：退火：
  • 化學合成的寡核-DT引物將其退火到RNA的3'polya-tail。底漆通常長10-15個殘基。
  • 在存在逆轉錄酶和脫氧核糖核苷酸的情況下，它素得多是第一個DNA鏈的合成。這留下了RNA：DNA雙鏈體。
• 步驟II：用DNA鏈代替RNA鏈：
  • RNA鏈被酶Hase H的幫助替換為DNA鏈。
  • RNase酶從RNA：DNA雙鏈體中除去RNA。現在留下的DNA鏈充當模板，而另一個由DNA聚合酶II合成的DNA鏈。

ii）。自我宣傳方法：

• 在這種方法中，將寡-DT底漆在mRNA的聚腺苷酸尾處退火，以使第一個DNA鏈合成對mRNA的啟動。
• 因此形成的cDNA傾向於暫時折疊自身，形成發夾環。
• 這導致了第二股的自我宣傳。
• 在合成第二個DNA鏈後，必須用單鏈特異性核酸酶（例如Si核酸酶）裂解該循環，以允許將其插入克隆載體。
• 這種方法有一個嚴重的缺點。
• 在克隆的5'端，用Si核酸酶切割會導致一定量的序列丟失。

iii）。Land等。戰略：

• 在第一鏈合成後，使用酶末端轉移酶用一串胞苷殘基尾cDNA，該酶像往常一樣用寡-DT底漆進行啟動。
• 對於合成的寡-DG底漆，然後將這種人造寡-DC尾巴用作退火位點，從而使第二鏈合成。

iv）。均聚物尾巴：

• 在這種方法中使用了可以將核苷酸聚合到DNA和RNA分子的3'-羥基中的酶末端轉移酶。
• 為了產生RNA：DNA雜交，第一DNA鏈的合成如前所述。
• 為了在RNA和DNA鏈的3'末端添加核苷酸尾巴，然後使用末端轉移酶和單個脫氧核糖核苷酸。
• 結果是，在其3'端，DNA鏈現在具有已知序列。通常使用DCTP或DATP。
• 現在，可以將互補的低聚物（化學合成）退火並用作指導第二鏈合成的底漆。
• 為了協助克隆所得的雙鏈cDNA，這種低聚物（以及用於第一鏈合成的cDNA）可以另外包含一個限製位點。

v）。cDNA末端的快速擴增：

• 根據我們感興趣的cDNA的結尾，比賽技術被分為3'race和5'race。
• 一個。3’種族：
  • 在這種類型的種族中，使用修飾的寡核-DT引物進行第一個DNA鏈的逆轉錄酶合成。
  • 該底漆涉及特定適配器序列的延伸，然後是寡-DT拉伸。
  • 第一個鏈合成之後是第二鏈合成，該鏈合成使用了啟示內部的底漆。
  • 這伴隨著使用的PCR
    • 一世。相同的內部底漆。
    • ii。適配器的序列（即省略寡核-DT）。盡管應該在理論上使用簡單的寡核-DT底漆，而不是適應器 - 橄欖色-DT和適配器組合，但低熔融溫度可能會幹擾隨後的PCR圓形圓圓圓環。
• b。5'種族：
  • 這種類型種族的第一個cDNA鏈與重新轉錄酶合成，並從編碼序列中進行底漆。
  • 它去除了未納入的底漆，並用寡-DA將cDNA鏈尾尾。
  • 使用Adaptor-Oligo-DT引物，然後合成第二個cDNA鏈。
  • 然後，使用此產生的雙鏈分子使用PCR進行PCR
    • 一世。嵌套在編碼區域內的底漆和
    • ii。在最終的PCR中，嵌套引物用於最大化特異性。由於堿性寡-DT底漆的熔化溫度低，因此在PCR中使用了適配器序列，如上麵的3'race中。各種套件可用於競賽。

3。cDNA克隆：

一個。Linkers：

• 最後，rnaseh和均聚物尾巴的方法產生了雙鏈，鈍的cDNA分子的集合。
• 矢量分子現在必須與它們結合。
• 這可以通過鈍性的連接，與相關酶的消化以及連接到矢量的消化或添加接頭。

b。限製站點的合並：

• 均聚物尾技術可以通過使用調整以納入限製的引物來調整。
• 最近合成的第一個cDNA鏈的3'末端與C尾尾。
• 然後在寡核苷酸短的雙鏈區域內再次出現了寡-DG底漆，然後用於第二鏈合成。
• 在此過程中，必須使用含有雙鏈區域的寡核苷酸。
• 這種寡核苷酸是通過分別合成兩條鏈的，然後允許它們彼此退火而形成的。

C。cDNA的均聚物尾巴：

• 另一個想法是重新使用末端轉移酶。
• 鈍性雙鏈cDNA用末端轉移酶和DCTP處理導致幾個C殘基（通常為20左右）到3'羥基的聚合。
• 載體的末端轉移酶和DGTP處理導致載體末端包含幾個G殘基。可以或者可以使用DATP和DTTP。
• 現在可以退火載體和cDNA，並且堿基的區域通常如此廣泛，以至於不需要DNA連接酶處理。
• 實際上，可能存在差距而不是劃痕，但矢量插入物的邊緣可能存在縫隙，但是一旦將重組分子插入宿主中，這些分子就會通過生理過程來修複。

cDNA庫的優點：

• cDNA庫有兩個主要好處。
• 首先，它充滿了已經積極轉錄的基因的片段。
• 其次，內含子不會破壞克隆的序列。如果目標是在細菌中創建真核蛋白，則內含子會引起問題，因為大多數細菌無需消除內含子。

cDNA庫的缺點：

• cDNA庫的缺點是它僅包括成熟mRNA中存在的序列。
• 在轉錄過程中沒有任何內含子和任何其他序列。未轉錄為RNA的序列（例如啟動子和增強子）也不存在於cDNA庫中。
• 同樣重要的是要記住，僅在RNA被分離的組織中表達的某些基因序列構成了cDNA文庫。
• 另外，在cDNA文庫中，特定DNA序列的頻率取決於給定組織中相應mRNA的豐度。
• 相反，在基因組DNA文庫中，幾乎所有基因都以相同的頻率存在。