cDNA庫:cDNA庫的建設過程,優勢和缺點




cDNA庫:cDNA庫的建設過程,優勢和缺點
cDNA庫:cDNA庫的建設過程,優勢和缺點

cDNA庫:

  • 借助酶逆轉錄酶從信使RNA(mRNA)產生的DNA副本稱為cDNA。
  • 一組cDNA片段已將其克隆到一個單獨的矢量分子中,該分子構成了生物體的一部分轉錄組,並將其存儲為庫,稱為cDNA文庫。

cDNA庫的原理:

  • 為了構建cDNA文庫,產生了來自生物體mRNA序列的DNA拷貝,然後克隆它們。
  • 給出一詞cDNA,因為庫中的所有DNA均與mRNA互補,並且通過mRNA的反轉錄產生。
  • 大多數真核DNA由未轉錄到mRNA的重複序列組成,在cDNA庫中,序列未表示。
  • 應當記住,原核生物和較低的真核生物不包含內含子,並且通常不需要為這些物種的cDNA製備。
  • 因此,cDNA文庫僅由較高的真核生物創建。
  • 為了構建cDNA文庫,細菌和噬菌體DNA都可以用作載體。

cDNA庫的建設涉及的過程:

1.從真核細胞中提取mRNA:

  • 首先,收集並純化了其餘RNA的mRNA。
  • 許多其他方法可用於純化RNA,例如Trizol提取和色譜柱純化。
  • 通過使用寡聚DT核苷酸塗層樹脂,僅在隻有具有多A尾的mRNA才能結合的情況下進行柱純化。
  • 通過使用寡聚DT核苷酸塗層樹脂,僅在隻有具有多A尾的mRNA才能結合的情況下進行柱純化。
  • 其餘的RNA洗脫了。
  • 使用洗脫緩衝液洗脫mRNA,並進行一些熱量,以將mRNA鏈與寡-DT分開。

2. cDNA結構:

  • 為了構建cDNA,有幾種不同的方法。這些討論如下:

一世)。RNase方法:

  • 原則:
    • 通過使用逆轉錄酶,合成互補的DNA形成RNA:DNA雙鏈體。現在,將RNA鏈被切到,然後被DNA取代。
  • 腳步:
  • 第一步:退火:
    • 化學合成的寡核-DT引物將其退火到RNA的3'polya-tail。底漆通常長10-15個殘基。
    • 在存在逆轉錄酶和脫氧核糖核苷酸的情況下,它素得多是第一個DNA鏈的合成。這留下了RNA:DNA雙鏈體。
  • 步驟II:用DNA鏈代替RNA鏈:
    • RNA鏈被酶Hase H的幫助替換為DNA鏈。
    • RNase酶從RNA:DNA雙鏈體中除去RNA。現在留下的DNA鏈充當模板,而另一個由DNA聚合酶II合成的DNA鏈。

ii)。自我宣傳方法:

  • 在這種方法中,將寡-DT底漆在mRNA的聚腺苷酸尾處退火,以使第一個DNA鏈合成對mRNA的啟動。
  • 因此形成的cDNA傾向於暫時折疊自身,形成發夾環。
  • 這導致了第二股的自我宣傳。
  • 在合成第二個DNA鏈後,必須用單鏈特異性核酸酶(例如Si核酸酶)裂解該循環,以允許將其插入克隆載體。
  • 這種方法有一個嚴重的缺點。
  • 在克隆的5'端,用Si核酸酶切割會導致一定量的序列丟失。

iii)。Land等。戰略:

  • 在第一鏈合成後,使用酶末端轉移酶用一串胞苷殘基尾cDNA,該酶像往常一樣用寡-DT底漆進行啟動。
  • 對於合成的寡-DG底漆,然後將這種人造寡-DC尾巴用作退火位點,從而使第二鏈合成。

iv)。均聚物尾巴:

  • 在這種方法中使用了可以將核苷酸聚合到DNA和RNA分子的3'-羥基中的酶末端轉移酶。
  • 為了產生RNA:DNA雜交,第一DNA鏈的合成如前所述。
  • 為了在RNA和DNA鏈的3'末端添加核苷酸尾巴,然後使用末端轉移酶和單個脫氧核糖核苷酸。
  • 結果是,在其3'端,DNA鏈現在具有已知序列。通常使用DCTP或DATP。
  • 現在,可以將互補的低聚物(化學合成)退火並用作指導第二鏈合成的底漆。
  • 為了協助克隆所得的雙鏈cDNA,這種低聚物(以及用於第一鏈合成的cDNA)可以另外包含一個限製位點。

v)。cDNA末端的快速擴增:

  • 根據我們感興趣的cDNA的結尾,比賽技術被分為3'race和5'race。
  • 一個。3’種族:
    • 在這種類型的種族中,使用修飾的寡核-DT引物進行第一個DNA鏈的逆轉錄酶合成。
    • 該底漆涉及特定適配器序列的延伸,然後是寡-DT拉伸。
    • 第一個鏈合成之後是第二鏈合成,該鏈合成使用了啟示內部的底漆。
    • 這伴隨著使用的PCR
      • 一世。相同的內部底漆。
      • ii。適配器的序列(即省略寡核-DT)。盡管應該在理論上使用簡單的寡核-DT底漆,而不是適應器 - 橄欖色-DT和適配器組合,但低熔融溫度可能會幹擾隨後的PCR圓形圓圓圓環。
  • b。5'種族:
    • 這種類型種族的第一個cDNA鏈與重新轉錄酶合成,並從編碼序列中進行底漆。
    • 它去除了未納入的底漆,並用寡-DA將cDNA鏈尾尾。
    • 使用Adaptor-Oligo-DT引物,然後合成第二個cDNA鏈。
    • 然後,使用此產生的雙鏈分子使用PCR進行PCR
      • 一世。嵌套在編碼區域內的底漆和
      • ii。在最終的PCR中,嵌套引物用於最大化特異性。由於堿性寡-DT底漆的熔化溫度低,因此在PCR中使用了適配器序列,如上麵的3'race中。各種套件可用於競賽。

3。cDNA克隆:

一個。Linkers:

  • 最後,rnaseh和均聚物尾巴的方法產生了雙鏈,鈍的cDNA分子的集合。
  • 矢量分子現在必須與它們結合。
  • 這可以通過鈍性的連接,與相關酶的消化以及連接到矢量的消化或添加接頭。

b。限製站點的合並:

  • 均聚物尾技術可以通過使用調整以納入限製的引物來調整。
  • 最近合成的第一個cDNA鏈的3'末端與C尾尾。
  • 然後在寡核苷酸短的雙鏈區域內再次出現了寡-DG底漆,然後用於第二鏈合成。
  • 在此過程中,必須使用含有雙鏈區域的寡核苷酸。
  • 這種寡核苷酸是通過分別合成兩條鏈的,然後允許它們彼此退火而形成的。

C。cDNA的均聚物尾巴:

  • 另一個想法是重新使用終端轉移酶。
  • 鈍性雙鏈cDNA用末端轉移酶和DCTP處理導致幾個C殘基(通常為20左右)到3'羥基的聚合。
  • 載體的末端轉移酶和DGTP處理導致載體末端包含幾個G殘基。可以或者可以使用DATP和DTTP。
  • 現在可以退火載體和cDNA,並且堿基的區域通常如此廣泛,以至於不需要DNA連接酶處理。
  • 實際上,可能存在差距而不是劃痕,但矢量插入物的邊緣可能存在縫隙,但是一旦將重組分子插入宿主中,這些分子就會通過生理過程來修複。

cDNA庫的優點:

  • cDNA庫有兩個主要好處。
  • 首先,它充滿了已經積極轉錄的基因的片段。
  • 其次,內含子不會破壞克隆的序列。如果目標是在細菌中創建真核蛋白,則內含子會引起問題,因為大多數細菌無需消除內含子。

cDNA庫的缺點:

  • cDNA庫的缺點是它僅包括成熟mRNA中存在的序列。
  • 在轉錄過程中沒有任何內含子和任何其他序列。未轉錄為RNA的序列(例如啟動子和增強子)也不存在於cDNA庫中。
  • 同樣重要的是要記住,僅在RNA被分離的組織中表達的某些基因序列構成了cDNA文庫。
  • 另外,在cDNA文庫中,特定DNA序列的頻率取決於給定組織中相應mRNA的豐度。
  • 相反,在基因組DNA文庫中,幾乎所有基因都以相同的頻率存在。